好文网为大家准备了关于谷氨酸发酵的文章,好文网里面收集了五十多篇关于好谷氨酸发酵好文,希望可以帮助大家。更多关于谷氨酸发酵内容请关注好文网。ctrl+D请收藏!氨基酸工艺学第二章谷氨酸发酵机制图文

第二章

谷氨酸发酵机制

第一节 谷氨酸发酵机制

.谷氨酸的作用：谷氨酸(gutamate，Glu， 谷氨酸五年级作文童年趣事的作用：谷氨酸 谷氨酸的作用 ， ， CHON)是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神 是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神 是中枢神经系统中一种最重要的 经递质，主要分布于大脑皮质、海马、 经递质，主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状 学习、记忆、神经元可塑性及大脑发育等方 体，在学习、记忆、神经元可塑性及大脑发育等方 面均起重要作用。此外，谷氨酸对心肌能量代谢 心肌能量代谢和 面均起重要作用。此外，谷氨酸对心肌能量代谢和 心肌保护起着重要作用 起着重要作用。 心肌保护起着重要作用。

一、谷氨酸生物合成途径

生物体内合成谷氨酸的前体物质是a-酮戊二酸 酮戊二酸， 生物体内合成谷氨酸的前体物质是 酮戊二酸， 是三羧酸循环(TCA循环 的中间产物，由糖质原料 循环)的中间产物 是三羧酸循环 循环 的中间产物， 糖酵解途径(EMP途径 、 途径)、 生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径 生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径 途径 三羧酸循环、乙醛酸循环、 的固定反应(伍德一 三羧酸循环、乙醛酸循环、CO的固定反应 伍德一 的固定反应 沃克曼反应)等 沃克曼反应 等。

（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环 ）、葡萄糖的糖酵解、 葡萄糖的糖酵解 和乙醛酸循环 葡萄糖

.糖酵解途径（EMP途径） 糖酵解途径（ 途径） 糖酵解途径 途径 将一分子葡萄糖分解成 一分子葡萄糖分解成 两分子丙酮酸,并且发生 两分子丙酮酸 并且发生 氧化(脱氢 脱氢)和生成少量 氧化 脱氢 和生成少量 ATP。 。

-磷酸葡萄糖 -磷酸葡萄糖酸 磷酸葡萄糖 磷酸葡萄糖酸

EMP途径 HMP途径

-磷酸甘油醛 磷酸甘油醛

-磷酸核酮糖 磷酸核酮糖

丙酮酸

.戊糖磷酸途径（HMP途径） 戊糖磷酸途径（ 途径） 戊糖磷酸途径 途径 可以生成酵解途径的中间产物-磷酸果糖和 可以生成酵解途径的中间产物 磷酸果糖和 磷酸果糖 -磷酸甘油醛。 磷酸甘油醛。 磷酸甘油醛

肌肉中的葡萄糖代谢情况

.三羧酸循环（TCA循环） 三羧酸循环（ 循环） 三羧酸循环 循环

丙酮酸

+CO

乙法制演讲稿酰CoA 乙酰

草酰乙酸 柠檬酸 苹果酸 顺乌头酸 延胡索酸 乙醛酸 异柠檬酸 琥珀酸 α-酮戊二酸

α-酮戊二酸脱氢酶 酮戊二酸脱氢酶 NH 异柠檬酸脱氢酶 乙醛酸循环中的两个关键 乙醛酸循环中的两个关键 异柠檬酸裂解酶和 酶——异柠檬酸裂解酶和 异柠檬酸裂解酶 苹果酸合成酶。 苹果酸合成酶。

谷氨酸 胞内） （胞内）

转移到胞外 转移到胞外

（二）谷氨酸合成的理想途径

生物素充足菌EMP所占比例约为 ％； 所占比例约为％； 生物素充足菌 所占比例约为 在发酵产酸期 所占比例更大， 在发酵产酸期，EMP所占比例更大，约为 ％。 产酸 所占比例更大 约为％。

（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径

.谷氨酸生产菌株为缺陷型，生产过程分为菌体生 谷氨酸生产菌株为缺陷型，生产过程分为菌体生 谷氨酸生产菌株为缺陷型 长期和谷氨酸积累期。 长期和谷氨酸积累期。 .此代谢途径至少有 步酶促反应。 此代谢途径至少有步酶促反应。 此代谢途径至少有 步酶促反应 .在谷氨酸发酵的菌体生长期，由于三羧酸循环中 在谷氨酸发酵的菌体生长期， 在谷氨酸发酵的菌体生长期 缺陷(丧失 丧失a-酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力 的缺陷 丧失 酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力 乙醛酸循环途径进行代谢 微弱)，谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环途径进行代谢， 微弱 ，谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环途径进行代谢， 提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。 提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。

. 在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，封闭 在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期 谷氨酸生成期， 乙醛酸循环，积累α 酮戊二酸， 乙醛酸循环，积累α-酮戊二酸，就能够大量生 积累谷氨酸。 成、积累谷氨酸。 因此在谷氨酸发酵中， 因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条 件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。 件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。

. 由葡萄糖生 物合成谷氨酸的 代谢途径

.葡萄糖对谷氨酸的转化率 葡萄糖对谷氨酸的转化率

（）在谷氨酸生成期，假如四碳二羧酸是 在谷氨酸生成期，假如四碳二羧酸是 通过C 固定反应供给，在生长期之后， ％通过C固定反应供给，在生长期之后，理 想的发酵按如下反应进行： 想的发酵按如下反应进行：

mol葡萄糖可以生成mol的谷氨酸， mol葡萄糖可以生成mol的高尚的作文谷氨酸，谷氨酸对葡萄 葡萄糖可以生成mol的谷氨酸 糖的质量理论转化率 质量理论转化率为 糖的质量理论转化率为：

（）在谷氨酸生成期，若 在谷氨酸生成期， 固定反应完全不起作用 完全不起作用， CO固定反应完全不起作用， 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催 化作用下，脱氢脱羧全部氧 化作用下， 化成乙酰CoA CoA， 化成乙酰CoA，通过乙醛酸 循环供给四碳二羧酸。 循环供给四碳二羧酸。反应 如下： 如下： CHO 乙醛酸循环： 乙醛酸循环： 乙酰 乙酰CoA +HO 琥珀酸 乙酰 琥珀酸+CoASH 琥珀酸 乙酰 乙酰CoA +NH+O 谷氨酸 谷氨酸+CO+HO 乙酰 谷氨酸 丙酮酸 丙酮酸 乙酰 乙酰CoA 乙酰

mol葡萄糖可以生成 葡萄糖可以生成mol的谷氨酸，谷氨 的谷氨酸， 葡萄糖可以生成 的谷氨酸 酸对葡萄糖的质量理论转化率 质量理论转化率为 酸对葡萄糖的质量理论转化率为：

()实际转化率：处于二者之间，即.%～ 实际转化率：处于二者之间， 实际转化率 ～ .%。 。 CO固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影 固定反应、 响较大。 响较大。 乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。 乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。

.醋酸或正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径 醋酸或正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径 醋酸 在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时， 在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时，却只能 经乙醛酸循环供给四碳二羧酸， 经乙醛酸循环供给四碳二羧酸，四碳二羧酸经草酰 乙酸又转化为柠檬酸。 乙酸又转化为柠檬酸。

二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制

分解代谢： 从环境中摄取营养物质， 分解代谢： 从环境中摄取营养物质，把它们转 微生物 的代谢

化为自身物质， 化为自身物质，以此来提供能源和 小分子中间体； 小分子中间体；

合成代谢：合成代谢将分解代谢产生的能量和 合成代谢：

中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质 中间体合成氨基酸、核酸、 等物质。 等物质。

在工业上，通过对微生物代谢途径的控制来满足 在工业上，通过对微生物代谢途径的控制来满足 对微生物代谢途径的控制 生产的需要，提高生产效益。 生产的需要，提高生产效益。 所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。 所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。

．糖代谢(EMP途径和 ．糖代谢 途径和HMP途径 的调节 途径)的调节 途径和 途径

糖代谢可分为分解与合成两方面。 糖代谢可分为分解与合成两方面。 分解 两方面 糖分解代谢包括酵解与三羧酸循环； 提供能量） 糖分解代谢包括酵解与三羧酸循环；（提供能量） 包括酵解与三羧酸循环 合成代谢包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成 合成代谢包括糖的异生、 包括糖的异生 中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。 等，中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。 消耗能量） （消耗能量）

()能荷的调节 能荷的调节 腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷 腺苷三磷酸 腺苷三磷酸)， 腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸 ， 简称为ATP。 简称为 。 其结构简式是：A—P～ 结构简式是： ～ P～P，其相邻的两个磷 ～ ， 酸基之间的化学键非常活 跃，水解时可释放约 .kJ/mol的能量， 的能量， 的能量 因此称为高能磷酸键。 因此称为高能磷酸键。

Atkinson提出了能荷的概念。 提出了能荷的概念。 提出了能荷的概念 认为能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量， 能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量 认为能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量， 能荷大小可以说明生物体中ATP—ADP—AMP系统的 能荷大小可以说明生物体中 系统的 能量状态。能荷的大小决定于ATP和ADP的多少。 的多少。 能量状态。能荷的大小决定于 和 的多少 能荷调节是通过ATP、ADP和AMP分子对某些酶 、 能荷调节是通过 和 分子对某些酶 分子进行变构调节来实现的。 分子进行变构调节来实现的。

能荷逐渐升高时，即细胞内的能量水平逐渐升高， 能荷逐渐升高时，即细胞内的能量水平逐渐升高， 这一过程中AMP、ADP转变成 转变成ATP。 这一过程中 、 转变成 。 ATP的增加会抑制糖分解代谢，抑制如柠檬酸合 的增加会抑制糖分解代谢 的增加会抑制糖分解代谢， 成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性， 成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性，并激活糖类合 成的酶，加速糖原的合成。 成的酶，加速糖原的合成。

糖酵解主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、 糖酵解主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、 主要受三个酶调节 丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶是限速酶， 磷酸果糖激酶是限速酶 丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶是限速酶，己糖激酶控制 酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循环的调控由 酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循环的调控由 三个酶调控， 柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和 酮戊 三个酶调控，即柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和ā-酮戊 二酸脱氢酶。两者都与能荷的控制调节相关。 二酸脱氢酶。两者都与能荷的控制调节相关。

当生物体内生物合成或其它需能反应加强时， 当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细 胞内ATP分解生成 分解生成ADP或AMP，ATP减少，能荷降低， 减少， 胞内 分解生成 或 ， 减少 能荷降低， 就会激活某些催化糖类分解的酶(糖原磷酸化酶 激活某些催化糖类分解的酶 糖原磷酸化酶、 就会激活某些催化糖类分解的酶 糖原磷酸化酶、磷酸 果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)或解除 果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等 或解除 ATP对这些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶 对这些酶的抑制， 对这些酶的抑制 并抑制合成糖原的酶(NN合成 合成 果糖-， ～二磷酸酯酶等)，从而加速酵解、 酶、果糖 ，～二磷酸酯酶等 ，从而加速酵解、 TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成 循环产生能量， 循环产生能量 通过氧化磷酸化作用生成ATP。 。

()生物素对糖代谢速率的调节 生物素对糖代谢速率的调节

生物素对糖代谢的调 节与能荷的调节是不同的， 节与能荷的调节是不同的， 能荷是对糖代谢流的调节， 能荷是对糖代谢流的调节， 而生物素能够促进糖的 EMP、HMP途径、TCA 途径、 、 途径 循环。 循环。

谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型。 谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型。许多研究表 生物素缺陷型 明，生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的 比例并没有显著的影响，主要作用是对糖降解速率的 比例并没有显著的影响，主要作用是对糖降解速率的 调节。 调节。

原因：碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的许多反应都需要生 原因：碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的许多反应都需要生 物素。 物素。 生物素的主要功能是在脱羧 羧化反应和脱氨反应中起辅酶 是在脱羧-羧化反应和脱氨反应中起 生物素的主要功能是在脱羧 羧化反应和脱氨反应中起辅酶 作用，并和碳水化合物与蛋白质的互变、 作用，并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白 质向脂肪的转化有关。 质向脂肪的转化有关。 在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。 在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。 碳水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有： 碳水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有：丙酮酸转化生成 草酰乙酸；苹果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变； 草酰乙酸；苹果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变；草 酰琥珀酸转化为α-酮戊二酸 酮戊二酸。 酰琥珀酸转化为 酮戊二酸。

．三羧酸循环(TCA循环 的调节 ．三羧酸循环 循环)的调节 循环

谷氨酸产生菌在代谢途径中， 谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要 是通过种酶的调节进行的 种酶的调节进行的。 是通过 种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、 酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢 酶和α-酮戊二酸脱氢酶 酮戊二酸脱氢酶。 酶和 酮戊二酸脱氢酶。

草酰乙酸+谷氨酸 草酰乙酸 谷氨酸

谷氨酸转氨酶

天冬氨酸+α 天冬氨酸 α-酮戊二酸

谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后， 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后， 谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶 的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。 的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。

①磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑 受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。 制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。 ②柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶， 是三羧酸循环的关键酶 荷调节外， 荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反 馈抑制。 馈抑制。

反馈抑制：是指最终产物抑制作用， 反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点 产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用 抑制作用。 产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。 反馈抑制与反馈阻遏的区别在于：反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢， 反馈抑制与反馈阻遏的区别在于：反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢， 反馈阻遏的区别在于 反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外， 反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催 化一系反应的多个酶 而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。 化一系反应的多个酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。

③异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不 异柠檬酸脱氢酶活力强， 活力强 能太强，这就有利于谷氨酸前体物α-酮戊二酸的生成 酮戊二酸的生成， 能太强，这就有利于谷氨酸前体物 酮戊二酸的生成， 满足合成谷氨酸的需要。 满足合成谷氨酸的需要。 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成α– 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成 酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸还 酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸还 原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应， 原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应， 细胞内α–酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡 酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡， 细胞内 酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡， 酮戊二酸过量时， 当α–酮戊二酸过量时，对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制 酮戊二酸过量时 作用，停止合成α–酮戊二酸 酮戊二酸。 作用，停止合成 酮戊二酸。

酮戊二酸的氧化途径， ④沿着由柠檬酸至α–酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产 沿着由柠檬酸至 酮戊二酸的氧化途径 生菌有两种NADP专性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L生菌有两种 专性脱氢酶， 异柠檬酸脱氢酶和 专性脱氢酶 谷氨酸脱氢酶。 谷氨酸脱氢酶。 在谷氨酸的生物合成中， 在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬 酸脱氢酶在铵离子存在下， 酸脱氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起 形成强固的氧化还原共轭体系，不与NADPH 来，形成强固的氧化还原共轭体系，不与 的末端氧化系相连接， 的末端氧化系相连接，使α–酮戊二酸还原氨基化生 酮戊二酸还原氨基化生 成谷氨酸。 成谷氨酸。

由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微生 由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微生 谷氨酸产生菌 物强大得多， 物强大得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧 化中间物就不再往下氧化， 化中间物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累 起来。 起来。 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈 阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性， 阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性， pH在.～.，谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺。 谷氨酰胺。 在 ～ ，谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺

酮戊二酸脱氢酶先天 ⑤在谷氨酸产生菌中，α–酮戊二酸脱氢酶先天 在谷氨酸产生菌中， 酮戊二酸脱氢酶 缺失或微弱， 性缺失或微弱，对导向谷氨酸形成具有重要意 这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征 重要特征。 义，这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征。 谷氨酸产生菌的α–酮戊二酸氧化力微弱，尤其 谷氨酸产生菌的 酮戊二酸氧化力微弱， 酮戊二酸氧化力微弱 在生物素缺乏的条件下，三羧酸循环到达α–酮 在生物素缺乏的条件下，三羧酸循环到达 酮 戊二酸时即受到阻挡，这有利于α–酮戊二酸的 戊二酸时即受到阻挡，这有利于 酮戊二酸的 积累，然后生成谷氨酸。 积累，然后生成谷氨酸。

．乙醛酸循环(DCA循环 的调节 ．乙醛酸循环 循环)的调节 循环

乙醛酸循环中的关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸 乙醛酸循环中的关键酶是异柠檬酸裂解酶和 异柠檬酸裂解酶 酶。通过乙醛酸循环异柠檬酸裂解酶的催化作用使 琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足， 琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足，其反应 如下： 如下：

葡萄糖和琥珀酸等对异柠檬酸裂解酶起着阻遏作用。 葡萄糖和琥珀酸等对异柠檬酸裂解酶起着阻遏作用。 等对异柠檬酸裂解酶起着阻遏作用

()以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对 以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对 DCA循环的影响 循环的影响 在生物素亚适量条件下，琥珀酸氧化力降低， 生物素亚适量条件下，琥珀酸氧化力降低， 条件下 积累的琥珀酸会反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性， 反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性 积累的琥珀酸会反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性，并 阻遏该酶的生成， 循环基本处于封闭状态， 阻遏该酶的生成，DCA循环基本处于封闭状态， 循环基本处于封闭状态 异柠檬酸高效率地转化为α-–酮戊二酸，再生成谷 酮戊二酸， 异柠檬酸高效率地转化为 酮戊二酸 氨酸。 氨酸。 生物素充足的条件下 的条件下， 在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性 增大，通过DCA循环提供能量，进行蛋白质的合 循环提供能量， 增大，通过 循环提供能量 成，不仅异柠檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得 谷氨酸减少， 谷氨酸减少，而且生成的谷氨酸在转氨酶的催化作 用下又转成其它氨基酸， 不利于谷氨酸积累。 用下又转成其它氨基酸，也不利于谷氨酸积累。

()以醋酸为原料的谷氨酸发酵对 以醋酸为原料的谷氨酸发酵对DCA循环的影响 以醋酸为原料的谷氨酸发酵对 循环的影响 以醋酸为原料发酵谷氨酸时，醋酸浓度要低， 以醋酸为原料发酵谷氨酸时，醋酸浓度要低，高浓度 的醋酸易被完全氧化。 的醋酸易被完全氧化。 循环启 当菌体内的有机酸浓度低到一定程度， 循环 当菌体内的有机酸浓度低到一定程度，DCA循环启 动，此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内 的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶 抑制异柠檬酸脱氢酶， 的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶，TCA循环转为 循环转为 DCA循环，不利于谷氨酸生成与积累； 循环， 循环 不利于谷氨酸生成与积累； 循环运转使得TCA循环包含的某些有机酸过剩 当DCA循环运转使得 循环运转使得 循环包含的某些有机酸过剩 异柠檬酸裂解酶被抑制 乙醛酸浓度下降， 裂解酶被抑制， 时，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除 对异柠檬酸脱氢酶的抑制， 循环运转。 对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转。 循环运转

．CO固定反应的调节 ．

固定反应主要通过以下途径完成： CO固定反应主要通过以下途径完成：

C的固定反应的作用：补充草酰乙酸； 的固定反应的作用：补充草酰乙酸； 在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与C 在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与 固定 的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题 是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。 的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。

．NH+的调节 ．

谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化脱氨反应， 谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化脱氨反应，脱 也能催化谷氨酸氧化脱氨反应 氨过程以NAD+作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向 作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向 氨过程以 氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的NADH被氧 氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的 被氧 化成NAD+，同时产生的 同时产生的NH很容易被除去。 很容易被除去。 化成 脱氨反应被NH+和α-–酮戊二酸所抑制，这对于谷 脱氨反应被 酮戊二酸所抑制， 酮戊二酸所抑制 积累也起到了很好的作用 氨酸的积累也起到了很好的作用。 氨酸的积累也起到了很好的作用。

在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌在 在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌在 NH+存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率 存在时， 不存在时，葡萄糖消耗速率很慢， 高； NH+不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生 成物是α-–酮戊二酸 丙酮酸等物质， 酮戊二酸、 成物是α-–酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨 酸。

四、细胞膜通透性的调节

对谷氨酸发酵的重要性： 对谷氨酸发酵的重要性： 当细胞膜转变为有利于谷 氨酸向膜外渗透的方式， 氨酸向膜外渗透的方式， 谷氨酸才能不断地排出细 谷氨酸才能不断地排出细 胞外， 胞外，这样既有利于细胞 内谷氨酸合成反应的优先 内谷氨酸合成反应的优先 连续性， 性、连续性，也有利于谷 胞外的积累。 氨酸在胞外的积累 氨酸在胞外的积累。

细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有 弹性的半渗透性膜 磷脂双分子层为其基本结构 半渗透性膜， 为其基本结构， 弹性的半渗透性膜，磷脂双分子层为其基本结构， 在双分子层中镶嵌蛋白质 镶嵌蛋白质。 在双分子层中镶嵌蛋白质。

根据细胞膜的结构特性， 根据细胞膜的结构特性，控制细胞膜 通透性的方法主要有两种 主要有两种： 通透性的方法主要有两种： 一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂 一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成， 合成的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜 不能形成完整的细胞膜； 合成的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜； 一种是通过干扰细菌细胞壁的形成， 一种是通过干扰细菌细胞壁的形成，使得细胞不能 干扰细菌细胞壁的形成 形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。 形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。 在膜内外渗透压差等因素影响下， 在膜内外渗透压差等因素影响下，细胞膜物理性损 增大膜的通透性。 伤，增大膜的通透性。

．控制细胞膜的形成 ．

①利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，限制 利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时， 生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时 发酵培养基中生物素的浓度。 发酵培养基中生物素的浓度。 生物素参与了脂肪酸的生物合成， 生物素参与了脂肪酸的生物合成，进而影响了 磷脂的合成和细胞膜的形成。 磷脂的合成和细胞膜的形成。 生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰 生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰 CoA羧化酶的辅酶，对脂肪酸的形成起促进作用。 羧化酶的辅酶， 羧化酶的辅酶 对脂肪酸的形成起促进作用。 选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成， 选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量 控制生物素添加，抑制不饱和脂肪酸的合成， 控制生物素添加，抑制不饱和脂肪酸的合成，使得 细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。 细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。

②利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添 利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时， 生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时 表面活性剂或饱和脂肪酸。 加表面活性剂或饱和脂肪酸。 在生物素过量的条件下， 在生物素过量的条件下，添加表面活性剂或饱和 脂肪酸仍能进行谷氨酸发酵，其原因在于这些物质对 脂肪酸仍能进行谷氨酸发酵，其原因在于这些物质对 生物素起拮抗作用，抑制不饱和脂肪酸的合成， 生物素起拮抗作用，抑制不饱和脂肪酸的合成，导致 细胞膜不完整， 油酸合成量减少，磷脂合成不足，使得细胞膜不完整 油酸合成量减少，磷脂合成不足，使得细胞膜不完整， 提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。 提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。常用的表面活性剂 有吐温-、吐温 有吐温 、吐温-等。常用的饱和脂肪酸有十七烷 等 硬脂酸等。 酸、硬脂酸等。

③利用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基 利用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基 油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵 油酸的浓度。 油酸的浓度。 油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力， 油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，直接影 响磷脂的合成，不能形成完整细胞膜， 响磷脂的合成，不能形成完整细胞膜，必须添加油酸才能 生长，所以通过控制油酸的添加量， 生长，所以通过控制油酸的添加量，实现细胞膜对谷氨酸 的通透性。 的通透性。 油酸过量时 该菌株只长菌或产酸少； 当油酸过量时，该菌株只长菌或产酸少；当油酸亚适 随着油酸的耗尽，细胞膜结构与功能发生变化， 量时，随着油酸的耗尽，细胞膜结构与功能发生变化，使 得谷氨酸的通透性提高。 得谷氨酸的通透性提高。

一种脂肪酸。 一种脂肪酸。 分子式CHO 分子式

④利用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵， 利用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵， 甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵 限制发酵培养基甘油的浓度 发酵培养基甘油的浓度。 限制发酵培养基甘油的浓度。 甘油缺陷型菌株不能自身合成α-– 甘油缺陷型菌株不能自身合成 磷酸甘油和磷脂， 磷酸甘油和磷脂，外界供给甘油 才能使其生长， 才能使其生长，因此可以通过控 制甘油添加量来控制细胞膜对谷 氨酸的通透性。 氨酸的通透性。 当甘油添加量过多 过多时 当甘油添加量过多时，磷脂正 常合成，菌体正常生长， 常合成，菌体正常生长，不产酸 或产酸低； 或产酸低； 当甘油添加量过少 过少时 当甘油添加量过少时，菌体生 长不好，产酸低， 长不好，产酸低，所以控制甘油 亚适量是控制的关键。 亚适量是控制的关键。

．控制细胞壁的形成 ．

细胞壁的骨架结构 是肽聚糖。 是肽聚糖。 对细胞壁形成的控 制方法： 制方法：添加青霉 头孢霉素C等 素、头孢霉素 等 β-内酰胺类抗生素。 内酰胺类抗生素。 内酰胺类抗生素

双糖单位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙 双糖单位： 乙酰胞壁酸（ ） 乙 乙酰胞壁酸 酰葡萄糖胺（ 酰葡萄糖胺（NAG） ）

青霉素控制细胞壁形成的原因： 青霉素控制细胞壁形成的原因： 青霉素是糖肽末端结构(D—Ala—D—Ala)的类似物， 的类似物， 青霉素是糖肽末端结构 与转肽酶的活性中心结合， 与转肽酶的活性中心结合，使转肽酶受到了不可逆的 抑制，糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁， 抑制，糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁， 使细胞膜处于无保护状态，易于破损，增大谷氨酸的 使细胞膜处于无保护状态，易于破损， 通透性。 通透性。

转肽酶功能：在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。转 转肽酶功能：在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。 肽酶识别特异多肽,催化不同的转肽反应 催化不同的转肽反应。 肽酶识别特异多肽 催化不同的转肽反应。

第二节

谷氨酸产生菌的选育

主要是棒杆菌属、短杆菌属、 主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属 中的细菌。 中的细菌。 目前，我国企业使用的谷氨酸产生菌主要有： 目前，我国企业使用的谷氨酸产生菌主要有： 北京棒杆菌AS ．； 北京棒杆菌 ． ； 钝齿棒杆菌AS ．； 钝齿棒杆菌 ． ； 天津短杆菌T-； 天津短杆菌 ； 它们的各种突变株。 它们的各种突变株。

黄色短杆菌

北京棒杆菌

杆状细菌

谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，自然选育、 谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，自然选育、 诱变选育、杂交选育、 诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选 育。

一、自然选育

也称自然分离， 也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工 处理而直接进行筛选的育种方法。 处理而直接进行筛选的育种方法。 以基因自发突变为基础。 基因自发突变为基础。 为基础 有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种， 有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种，使谷氨酸生产 具有相对稳定性，提高发酵水平。 具有相对稳定性，提高发酵水平。 缺点： 缺点：菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作 使得自发突变率极低，导致选育耗时长、 用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作 量大、效率低。 量大、效率低。

二、诱变选育

物理因素：紫外线、 射线、 射线 射线、 物理因素：紫外线、Co、X射线、γ-射线、快中 、 射线 射线、 射线 超声波、 射线、 激光辐照、 子、α-射线、β-射线、超声波、He-Ne激光辐照、 射线 激光辐照 离子束等。 离子束等。 化学因素：氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、 化学因素：氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺 酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、-氟尿嘧啶 氟尿嘧啶、 酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、-氟尿嘧啶、溴尿嘧啶等。 溴尿嘧啶等。 其它因素：生物诱导因子， 其它因素：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变 等。

例： 王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌TZ 的诱变 TZ王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌TZ-的诱变 中国调味品，年 选育及其发酵的研究 。中国调味品，年 期 。 摘要：以天津短杆菌Ｔ 为出发菌株 为出发菌株， 摘要：以天津短杆菌Ｔ-为出发菌株，经Ｃ 射线、紫外线和硫酸二乙酯复合诱变并经高温 ｏ—γ射线、紫外线和硫酸二乙酯复合诱变并经高温 驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。 驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。 该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（ＧＡ）、 （ＧＡ）、不分解利 该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（ＧＡ）、不分解利 ＧＡ及耐高温 ℃ ℃ 的优点。 及耐高温（ 用ＧＡ及耐高温（℃～℃）的优点。

三、杂交育种

常规杂交 杂交育种 原生质体融合 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解 作用加以剥除，制得原生质体或原生质球， 作用加以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条 件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生质体凝 助融， 件下混合，由聚乙二醇 助融 融合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组， 集、融合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组， 在再生细胞中获得重组体。 在再生细胞中获得重组体。

谷氨酸产生菌的前处理 因为其有着特殊的细胞壁结构， 因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不 敏感。 敏感。 方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸 ）、甘氨酸、青霉 ）、甘氨酸 甘氨酸、 方法：加入 （ 素和D-环丝氨酸等 环丝氨酸等， 素和 环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得 疏松，便于溶菌酶处理。 疏松，便于溶菌酶处理。

如，李蒲兴等将株谷氨酸产生菌以 李蒲兴等将 株谷氨酸产生菌以 甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同组合 甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同组合 处理，对其原生质体形成进行比较， 处理，对其原生质体形成进行比较， 在最佳条件下，原生质体形成率 形成率可达 在最佳条件下，原生质体形成率可达 ％～ ％～％。 ％～ ％。

张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌 T-为出发菌株，获得了具有目的 为出发菌株， 为出发菌株 遗传标记寡霉素抗性(O 和氟乙酸抗 遗传标记寡霉素抗性 rm)和氟乙酸抗 的突变株TN和TN。 性(FEAr)的突变株 的突变株 和 。 然后，分别以TN和TN为亲株， 为亲株， 然后，分别以 和 为亲株 通过原生质体融合，获得了具有O 通过原生质体融合，获得了具有 rm +FEAr标记的融合子 标记的融合子FTN，其原 ， 生质体融合频率为.×-。 生质体融合频率为 ×

Orm

+

FEAr

Orm

FEAr

Orm FEAr

四、代谢控制选育

Glu产生菌 产生菌

以诱变育种为基础， 以诱变育种为基础，获得 各种解除或绕过微生物正 常代谢途径的突变株， 常代谢途径的突变株，从 而人为地使有用产物选择 性地大量生成积累。 性地大量生成积累。

诱变育种 突变株 代谢控制发酵 大量积累Glu 大量积累

.选育耐高糖、高谷氨酸的菌株 选育耐高糖、 选育耐高糖 如选育在含％～ ％ 如选育在含 ％～％葡萄糖的平板上生长良好的 ％～ 耐高糖突变株； 耐高糖突变株； 在含 ％～ ％味精的平板上生长良好的耐高谷 ％～％ 在含 氨酸突变株； 氨酸突变株； 在％的葡萄糖加 ％味精的平板上生长良好的耐 ％的葡萄糖加％ 高糖、耐高谷氨酸的菌株。 高糖、耐高谷氨酸的菌株。

.选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断 选育能强化谷氨酸合成代谢、 选育能强化谷氨酸合成代谢 支路代谢的菌株 （）选育不分解利 ） 用谷氨酸的突变株

谷氨酸

瓜氨酸 鸟氨酸 精氨酸 谷氨酰胺

选育在以谷氨酸为 选育在以谷氨酸为 唯一碳源培养基上 唯一碳源培养基上 不长或生长微弱的 突变株 。

（）选育强化 固定反应的突变株 ）选育强化CO a.选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好的 选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好的 选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源 菌株。 菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧 反应，该反应与C 固定反应是相同酶所催化， 反应，该反应与 固定反应是相同酶所催化， 固定反应相应地加强。 C固定反应相应地加强。

b.选育氟丙酮酸敏感突变株。 选育氟丙酮酸敏感突变株。 选育氟丙酮酸敏感突变株 因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂， 因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制 丙酮酸向乙酰CoA转化，相应地 固定反应加强。 转化， 丙酮酸向乙酰 转化 相应地CO 固定反应加强。 突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。 突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。 c.选育减弱乙醛酸循环的突变株。 选育减弱乙醛酸循环的突变株。 选育减弱乙醛酸循环的突变株 乙醛酸循环减弱不仅能使C 固定反应比例增大， 乙醛酸循环减弱不仅能使 固定反应比例增大， 而且异柠檬酸也能高效率地转化为α-酮戊二酸 酮戊二酸， 而且异柠檬酸也能高效率地转化为 酮戊二酸， 再生成谷氨酸。 再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型 突变株和不分解利用乙酸的突变株。 突变株和不分解利用乙酸的突变株。

（）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的 ） 突变株

α-酮戊二酸 NH

谷氨酸脱氢酶

谷氨酸

谷氨酸转氨酶

天冬氨酸+α 天冬氨酸 α-酮戊二酸

草酰乙酸

有酮基丙二酸抗性突变株、 有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性 突变株和谷氨酰胺抗性突变株。 突变株和谷氨酰胺抗性突变株。

（）选育强化能量代谢的突变株 ） 原因： 循环前一段代谢加强， 原因：使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成速 循环前一段代谢加强 率加快。 率加快。

a.选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二 选育呼吸链抑制剂抗性突变株 氧化丙二酸、氰化钾、 酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来 实现。 实现。 b.选育 选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育 选育 磷酸化抑制剂抗性突变株 ,-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实 二硝基酚、 二硝基酚 羟胺、 现。 c.选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如 选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。 可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。

（）其它遗传标记 ）

选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、 选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸 类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、 类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸 缺陷、 抗性、 抗性、 缺陷、AEC抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨酸等突 抗性 抗性 变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。 变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。

.选育能提高谷氨酸通透性的菌株 选育能提高谷氨酸通透性的菌株

生物素缺陷型菌株 （）选育生物素缺陷型菌株。 ）选育生物素缺陷型菌株。 油酸缺陷型菌株 （）选育油酸缺陷型菌株。 ）选育油酸缺陷型菌株。 （）选育甘油缺陷型菌株。 ）选育甘油缺陷型菌株。 甘油缺陷型菌株 温度敏感型突变株 （）选育温度敏感型突变株 ）选育温度敏感型

突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜 突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜 结构的基因上 发生碱基的转换或颠换， 结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一 个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导 个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活， 致细胞膜某些结构的改变。 致细胞膜某些结构的改变。 另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨 酸。

()其它突变型菌株 其它突变型菌株 抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、 抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙 酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增 酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增 强谷氨酸的通透性。 强谷氨酸的通透性。

五、基因工程选育

基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进 行改造而获得高产工程菌， 行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的 转基因而获得新菌种的育种方法。 转基因而获得新菌种的育种方法。

一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体， 载体系统 ：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒 为多。 为多。 受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。 受体系统 ：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。 供体菌株： 供体菌株：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异 株。 工具酶：切割供体 和载体DNA的工具酶 的工具酶——限制性内切 工具酶：切割供体DNA和载体 和载体 的工具酶 限制性内切 核酸酶有许多种， 效果最好。 核酸酶有许多种，HindⅢ、Bcl I、Xba I和Xam I效果最好。 Ⅲ 、 和 效果最好

载体系统 受体系统 供体菌株 工具酶

谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因已被克隆，Ozaki等克 谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因已被克隆， 等克 关键酶的基因已被克隆 隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因， 隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因， 通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了％。 通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了 ％。 周盛等从大肠杆菌E.coli k-中通过 中通过PCR克隆出 克隆出磷酸果糖 周盛等从大肠杆菌E.coli k-中通过PCR克隆出磷酸果糖 激酶编码基因(pfkA)，将其连到表达载体，连接构建成重 载体， 激酶编码基因 ，将其连到表达载体 组质粒pKu-，转化谷氨酸棒杆菌 ，并得到表达；酶活 谷氨酸棒杆菌B，并得到表达； 组质粒 ，转化谷氨酸棒杆菌 性测定表明pf-kA基因表达活力为 基因表达活力为.±o.u／g的蛋 性测定表明 基因表达活力为 ± ／ 的蛋 糖转化率比 高 ％，产酸 同时，转化子菌株对糖转化率 ％， 白。同时，转化子菌株对糖转化率比B高.％，产酸 率比B高.％。 高 ％。



柠檬酸钠对L谷氨酸发酵代谢流迁移的影响第卷第期年月

天津科技大学学报

Ｊｅｍ－ｍｌｏｆＴｉａａｊｌａ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

ｏｆｓｃ胁矗Ｔｅｅｉｍｅｅｇｙ

Ｖｂｌ．Ｎｏ．

Ａｐｒ．

柠檬酸钠对三一谷氨酸发酵代谢流迁移的影响

宋

翔，谢希贤，徐庆阳，陈宁

（工业微生物教育部重点实验室．天津科技大学生物工程学院，天津）

摘要：为更全面深入地理解细胞内谷氨酸代谢的调控机制，以黄色短杆茵ＧＤＫ－为供试茵株，应用ＭＡＴＬＡＢ软件和代谢流分析方法，定量研究了添加柠檬酸钠后Ｌ一谷氨酸发酵中后期胞内的代谢流迁移．在Ｌ一谷氨酸发酵中后期添加．ｇ几柠檬酸钠后，合成副产物￡一丙氨酸和乳酸的代谢流量明显减少，分剐降低了．％和．％，ＥＭＰ途径和乙醛酸循环的代谢流分别减少了．和．，ＨＭＰ途径的代谢流增加了．．而￡一谷氨酸生物合成的代谢流从．增长至．，较未添加前提高了．％．添加柠檬酸钠能使关键节点发生代谢流迁移．提高三一谷氨酸合成中心代谢途径的代谢流量．

关键词：￡一谷氨酸；代谢流分析；线性规划；黄色短杆菌中图分类号：Ｑ

文献标志码：Ａ

文章编号：－（）－－

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅ

ｏｎ

Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ

ＦｌｕｘＴｒａｎｓｆｅｒｏｆ

Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃＡｃｉｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ＳＯＮＧＸｉａｎｇ，ＸＩＥＸｉ—ｘｉａｎ，ＸＵ

Ｑｉｎｇ－ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ

Ｎｉｎｇ

（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，

ＣｏｕｃｇｃｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｉｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｍｊｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｈｅ

ｏｆＬ－ｇｈｔａｍｉｃａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｔｒａｎｓｆｅｒｄｕｒｉｎｇ

ｍｉｄｄｌｅａｎｄｌａｔｅ

ｐｍｏｄ

ｏｆ

ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇＭＡＴＬＡＢｓｏｆｔｗａｒｅｗｉｔｈ

ａｓ

Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ

ｆｌａｖｕｍ

ＧＤＫ?ｔｈｅｔｅｓｔ

ｓｔｒａｉｎ．Ｗｈｅｎ

．ｇ／ＬｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅＷａｓａｄｄｅｄ

ｔｏｔｈｅ

ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ．ｔｈｅ

ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｓｕｃｈ舔￡一ａｌａａｎｄＬａｃ．ｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ．％ａｎｄ．％．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ。ｔｈｅｆｌｕｘｃｈａｎｎｅｌｅｄｔｏＥＭＰａｎｄｇｌｙｏｘｙｌｃｉｒｃｌｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙＯ．ａｎｄ．，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｈｏｗｅｖｅｒ。ｔｈｅｆｌｕｘｃｈａｎｎｅｌｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ．．Ｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｃｈａｎｎｅｌｅｄ

ｔｏ

ｔＯ

ＨＭＰ

ｔｈｅＪ已－ｇｈｔａｍｉｃａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ

．％（ｆｒｏｍ．ｔｏ

．）．ＡＩｌｏｆｔｈｅｓｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅｃｏｕｌｄｃｈａｎｇｅｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｋｅｙｎｏｄｅ

ａｎｄｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎ

ｔｈｅ￡一ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ；ｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌａｘａｎａｌｙｓｉｓ；ｌｉｎｅａｒｐｒｏｇｒａｍ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｖ．ｍ

￡一谷氨酸在医药、食品、化妆品工业、农业及人造制革等领域中有着广泛应用．针对目前我国整个氨

基酸生产行业产酸水平和糖酸转化率与国际同行业先进水平（尤其是日本）尚有不小差距的现状ｌｌ。Ｊ，有必要应用代谢工程等先进方法改造生产菌株并优化

一，对于理解细胞谷氨酸代谢的调控机制具有十分重

要的意义ｐ｛Ｊ．已有基于途径分析和代谢流量分析的￡一谷氨酸发酵过程优化方面的相关研究【¨】，但目前

尚未有黄色短杆菌合成Ｌ一谷氨酸过程中添加某物质引起代谢流迁移的相关报道．本文旨在定量研究添加柠檬酸钠后三一谷氨酸发酵中后期胞内的代谢流迁移，确定关键节点处代谢流量的分配变化对￡一谷氨

发酵过程控制工艺．代谢流分析（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ

Ｆｌｕｘ

Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＭＦＡ）作为代谢网络定量分析的重要手段之

收稿日期：—－－；修回日期：—一ｌｌ

基金项目：国家高技术研究发侵计划“项目”（ＡＡ）；天津科技大学引进人才科研启动基金资助项目（）作者简介：宋翔（甜一）．男，山西太原人，须士研究生．

万方数据

??

酸生物合成的影响．这对于进一步改造生产菌株，优

些孝璧彗型』：萋：。堡毫三？氨酸的糖酸转化率及产酸水平具有重要的指导意义．

材料与方法

．

菌种

黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌ口ｖｕｍ）ＧＤＫ．，天

津科技大学代谢ｒ丁程研究室保藏菌株．．培养基与培养方法

培养基成分参见文献【】．

斜面活化培养：℃培养￣ｈ．

种子培养：ｍＬ三角瓶中装液量ｍＬ，层纱布封口，于旋转式摇床上℃、ｒ／ｍｉｎ振荡培养—

ｈ．

Ｌ罐发酵：装液量Ｌ，接种量ｍＬ，—℃，通风比ｌ：ｌ，自动流加氨水控制ｐＨ．，通过流加泡敌消泡，搅拌转速依据所需设定，发酵到一定时间开始流ｊ＝Ｊｎ％葡萄糖补料液，发酵ｈ．

．分析方法【

发酵液中氨基酸含量的测定：采用Ｅｌｉｔｅ—Ａ从氨

基酸分析仪进行柱前衍生测定（色谱分离条件：柱温℃；检测波长ａｍ；流动相总流量ｌｍＬ／ｍｉｎ）．

残糖、谷氨酸和乳酸的测定：采用ＳＢＡ－Ｃ生物传感仪测定．

．谷氨酸生物合成代谢流平衡模型的建立方法

谷氨酸生物合成代谢流平衡模型的建立见参考文献［】．Ｌ一谷氨酸生物合成的代谢网络如图ｌ所示．

图

Ｌ一谷氨酸生物合成代谢网络及理想代谢流分布

Ｆｉｇ．

ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｉｄｅａｌｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＬ—ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

万方数据

天津科技大学学报第卷第期

结果与讨论一。

’…

．

理想代谢流量分布

在前期研究Ｔ作［】中，已运用基元模型分析方法

对￡一谷氨酸发酵过程进行了途径分析，得到了Ｌ一谷

氨酸合成的理想代谢途径．本文将其计算出的￡一谷氨酸合成理想代谢流分布结果绘制成网．由图可知，在理想代谢途径中，￡一谷氨酸的最大理论摩尔得率为％，而其相应的质量得率为．％．

在￡一谷氨酸合成的理想代谢途径中，丙酮酸向丙氨酸和乳酸转化的酶活性完全丧失，反应完伞被阻断，这样可以使代谢流最大限度地流向合成￡一谷氨酸的方向．因此．丙酮酸是￡一谷氨酸合成的关键节点．

异柠檬酸既是Ｌ一谷氨酸合成的直接前体，亦是￡一谷氨酸合成的关键节点．异柠檬酸合成所需的草酰乙酸是由乙醛酸循环和Ｃ固定反应所提供的．而异柠檬酸本身又是从ＴＣＡ循环转向乙醛酸循环的入口代谢物，故异柠檬酸作为￡一谷氨酸合成的关键节点，有着调节和平衡ＴＣＡ循环与乙醛酸循环间流量分配比例的关键作用．

．添加柠檬酸钠前后的代谢流迁移

一磷酸葡萄糖、丙酮酸和异柠檬酸是黄色短杆菌ＧＤＫ．合成Ｌ一谷氨酸代谢网络的关键节点．当ＥＭＰ途径的流量超过ＴＣＡ循环的代谢能力时，丙酮酸的进一步代谢受阻，故通过其他途径进行代澍，进而导致乳酸、￡一丙氨酸等副产物的生成，造成碳架的浪费．因此，在补料分批发酵生产￡一谷氨酸的过程中，适当减少ＥＭＰ途径的代谢流量，降低副产物乳酸、￡一丙氨酸、￡一赖氨酸等的生成，以及控制乙醛酸循环和ＴＣＡ循环间的流量分配，是提高￡一谷氨酸发酵产酸率和糖酸转化率的关键．

有关研究【田】表明，添加柠檬酸钠能够使枯草芽孢杆菌代谢途径中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活

力显著降低．另有文献叫Ｉ】报道，有机酸等副产物的

合成会受到葡萄糖和柠檬酸联合代谢的阻遏，并由于葡萄糖的限制供应而相应减少．

本文拟对细胞的整体代谢网络进行代谢网络定

量分析，并以此为着手点，着重对添加柠檬酸钠前后移进行分析，以期找到菌种改造和发酵过程控制优化

的新突破点，以实现Ｌ一谷氨酸生物合成代谢流的进一步强化，从而使￡一谷氨酸发酵产酸水平及糖酸转化率得以大幅度提高．

￡一谷氨酸生物合成中的关键节点所发生的代ｉ身｝流迁

??

在发酵培养基中不添加或添加．ｇ／Ｌ柠檬酸钠，分别对其发酵中后期进行代谢流分析，并对其代谢流迁移进行研究．测定发酵中后期葡萄糖、种氨基酸（￡一谷氨酸、￡一丙氨酸、Ｌ一赖氨酸）和乳酸的产

柠檬酸钠后生成￡一丙氨酸的代谢流（ｒ）降低了

．％，生成乳酸的代谢流（ｒ）降低了．％，生成Ｌ一赖氨酸的代谢流（ｒ）降低了．％，均较未添加时有明显的减少．说明柠檬酸钠的添加可以有效地限制葡萄糖的供应，且其与葡萄糖的联合代谢阻遏了副产物乳酸、￡一丙氨酸和Ｌ一赖氨酸的生成和积累，使

量，并对其变化速率及代谢流量进行计算，结果分别

见表ｌ、表．运用ＭＡＴＬＡＢ软件通过线性规划计算得到柠檬酸钠添加前后￡一谷氨酸发酵中后期的代谢流分布，结果分别见图、图．由此可见，添加．／Ｌ

得由丙酮酸节点流向￡一谷氨酸生物合成途径的代谢

流明显增加，从而利于Ｌ一谷氨酸的大量积累．

表添加柠檬酸钠前后代谢产物的产量

Ｔａｂ．

Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｗｉｔｈ

ｏｒ

ｗｉｔｈｏｕｔｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ

柠檬酸钠／（ｇ．Ｌ－ｊ）

Ｏ．Ｏ

时间，ｌＩ

葡萄糖

ｌｌ

￡一丙氨酸

ｌ?．ｌ?．

产尝“

?．Ｏ?．

￡一赖氨酸

Ｏ．．?Ｉ．Ｉ

￡—谷氨酸

ｌ

．

表添加柠檬酸钠前后代谢产物变化速率及代谢流量

Ｔａｂ．

代谢物葡萄糖工一丙氨酸乳酸工一赖氨酸￡一谷氨酸

Ｖａｒｉａｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄ

ｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｗｉｔｈ

ｏｒｗｉｔｈｏｕｔｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ

Ｍ案霈速率代“锱

，ｌ

．

．．．Ｏ．．

票翥累速副佃洲等

．Ｉｌ．．．．

．．．．．ｌｌ

硎。代谢流量添加

．．．．

．．．

．

Ｏ．．．

∞

．．

．；

圈未添加柠檬酸钠的工一谷氨酸合成代谢流分布毋昏

ＭｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＬ－ｇｌｕｔａｍｌｃａｃｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ

图添加柠檬酸钠后￡一谷氯酸合成代谢流分布

耶ｇ．

ＭｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＬ?ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｔｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ

．添加柠檬酸钠前后ＧＰ节点代谢流量变化

由图、图可知，未添加柠檬酸钠时，进人ＥＭＰ

．，进入ＨＭＰ途径的代谢流为．．由此可知，添加柠檬酸钠可以增加ＨＭＰ途径代谢流量，减弱ＥＭＰ途径代谢流量，这与文献报道的枯草芽孢杆菌代谢流分布受柠檬酸钠的影响一致‘】．丙酮酸激酶

的代谢流为．，进入ＨＭＰ途径的代谢流为

．．添加．ｇ／Ｌ柠檬酸钠后，进入ＥＭＰ的代谢流为

万方数据

??

和磷酸果糖激酶作为ＥＭＰ途径中的关键酶，同时受到了柠檬酸的强烈抑制作用．而ＥＭＰ途径向ＨＭＰ途径发生的代谢流迁移，使ＨＭＰ途径的流量增加，从而增加了作为￡一谷氨酸合成中心代谢途径中关键反应所需还原力的ＮＡＤＰＨ的量，从而使更多的代谢流流向￡一爷氨酸．

．添加柠檬酸钠前后ＩＣＴ节点代谢流量变化

异柠檬酸是Ｌ一谷氨酸生成途径?｝Ｉ的关键节点，亦是￡一谷氨酸生物合成的直接前体．由图、图可知，未添加柠檬酸钠时进入乙醛酸循环的代谢流为．，而继续进入ＴＣＡ循环的代谢流为．．添加

．

ｅ／Ｌ柠檬酸钠后，进入乙醛酸循环的代谢流为

．，而继续进入ＴＣＡ循环的代谢流为．．由此可见，柠檬酸钠的添加使一部分乙醛酸循环的代谢流向着继续ＴＣＡ循环的方向迁移，使异柠檬酸更多地生成Ｏｔ．ＫＧ，进而更多地生成￡一谷氨酸，而非合成乙醛酸和琥珀酸．

．添加柠檬酸钠前后Ｐｙｒ节点代谢流量变化

丙酮酸也是三一谷氨酸生成途径中的关键节点．ＴＣＡ循环以及有机酸、氨基酸的合成都需要丙酮酸的直接或间接参与．由图、图可知，未添加柠檬酸钠时，由Ｐ”生成乳酸和￡一丙氨酸的代谢流分别为．和．．在添加柠檬酸钠后，由Ｐｙｒ生成乳酸和￡一丙氨酸的代谢流分别为．和．．柠檬酸钠的添加减弱了ＥＭＰ途径，缓解了ＥＭＰ途径和ＴＣＡ循环之间存在的“碳源溢流”【ｌ引，从而减少流向副产物（乳酸和￡一丙氨酸）代谢流并向三一谷氨酸合成途径发生代谢流迁移．另外，柠檬酸钠的添加会对作为ＴＣＡ循环限速酶的柠檬酸合成酶的活性产生竞争性抑制，限制ＴＣＡ循环的代谢流量，减少Ｃ的生成，避免碳架的大量浪费．

结语

应用代谢流分析技术定量研究了添加适量柠檬酸钠对￡一谷氨酸发酵过程中后期细胞内代谢流迁移的影响．柠檬酸钠的添加使合成副产物￡一丙氨酸、乳酸、￡一赖氨酸的代谢流量分别减少了．％、．％、．％，ＥＭＰ途径和乙