一、优化实践教学体系，设置独立的实践课
从2002年开始，我们结合我校人才培养目标及具体情况，制定了本科生《分子生物学实践》及《基因工程实践》的教学大纲，开设了相应独立的实践课程，设计了质粒提取、PCR技术、DNA电泳、限制性内切酶技术、DNA片段的胶回收、外源基因的连接及重组DNA的转化、筛选和鉴定等最基本需要掌握的实践。同时，我们还自编了内容详细、操作具体的实践教材。从2002年第一次开课至今已经过去了十多年，实践课取得了一定的成绩，根据课上学生上课情况和完成的实践报告上看，学生反应良好，能积极动手动脑并提出问题，实践报告也完成得认真、仔细。学生掌握了这些基本实践的原理和操作，对将来从事中药相关领域的研究工作有一定的帮助。但是在这十多年的教学实践中，我们也发现了问题，由于该课程的实践内容全都是验证性实践，实践设计为“教师包办型”，从试剂配制到操作步骤教师都已经准备好，学生只是按照规定的步骤按部就班地做实践就行了，在这样的教学模式下学生的行为受到限制，对教师和教材依赖性强，限制了发挥学生主动思维的空间。
二、改革实践教学内容，强调综合性和连贯性
由于验证性实践限制了学生发挥主动思维的空间，因此，必须建立分子生物学实践教学创新培养新模式，从验证性实践过渡到以设计性、综合性实践为主，重点培养学生在科研中的综合思维能力及实际动手操作能力，变被动灌输为主动思考，为学生今后进实践室从事相关领域的科学研究做准备。我们在改革中强调实践的综合性和连贯性，如学习重组DNA技术时，我们安排了5个实践：重组质粒的提取，DNA的酶切，DNA凝胶电泳及片断的胶回收，外源基因的连接，重组DNA的转化、筛选及鉴定。这五个实践包括了重组DNA技术的五个核心内容“分、切、接、转、筛”。我们把这5个实践串联成一个综合实践，使其具有连贯性。每次实践结束时的样品正好是下次实践的材料，这些实践将变成一整套前后关联的有机整体，一环扣一环，只有这5个实践全部操作成功了，才能最后得到自己需要的克隆。这种综合性实践使学生在整个过程中面临着挑战，也使最终成功得到产物的学生有成就感；不仅能培养学生综合实践操作能力，还能培养学生团结协作的精神和对科学研究的兴趣。
三、开放型教学模式，提高教学质量
在传统的实践课教学中，学生除了在规定的上课时间，机械地完成规定的实践任务外，几乎没有机会进入实践室，学生的主观能动性得不到发挥。开放实践室，为学有余力的学生提供更多时间和空间显得很有必要的。但对于多数中医院校来说，由于实践室资源紧张，在开放方面一直实行得不够。这次，我们尝试对学生开放实践室，鼓励学有余力的学生进入实践室，开展相关的分子生物学实践研究，取得了一些成绩。我们首先在课堂上向学生介绍本课程组教师在课题研究中所用到分子生物学实践技术。有不少学生对教师的科研课题感兴趣，我们组织感兴趣的学生，在业余时间来课题组和教师一起进行了相关分子生物学的实践研究。通过和研究生共同实践，加强了理论课的知识。其次，我们组织学生利用所学到的分子生物学知识，以小组为单位，通过课下查阅资料，完成了科研小课题的实践设计。学生在课堂上讨论了他们设计的小课题，通过教师评价并与教师一起讨论，调动了学生的学习兴趣，激发了学生活跃的思维，通过讨论进一步修正方案，使其更加完善。同时，教师利用业余时间，组织感兴趣的学生进行了正式实践。最后，在课堂中，我们抽出15分钟，让做实践的学生讲了具体实践的体会和出现的问题，与大家分享成功的快乐和失败的经验。学生听得都非常认真，讨论得也很热烈，大家都觉得这种实践教学模式非常好，增长了很多知识，如果时间允许，希望能多些这种实践教学模式。
总之，通过分子生物学实践教学创新培养模式的尝试，取得了很好的反馈，既给学生介绍了先进的知识内容，拓展了视野，又激发了学生的学习兴趣，增强了学生对于学习医学分子生物学知识的学习热情，培养了他们的研究创新能力和科学素养。
作者张前华茜解华郭淑贞单位北京中医药大学基础医学院
1材料与方法
1.1采集地点的选择伊宁县位于东经80°13′～82°42′，北纬43°35′～44°29′之间，东邻尼勒克县，西与伊宁市和霍城县接壤，南邻伊犁河，与察布查尔、巩留两县隔河相望。同时，位于伊犁河谷中部，水草丰富，境内的伊宁口岸是伊犁地区重要的贸易口岸。
1.2实验材料
1.2.1蜱的来源2013年4－5月，从伊宁县的2个采集点、2个绵羊群，每群＞30只，均未药浴，采集其体表寄生蜱，共获得硬蜱324只，放置于潮湿阴暗处，以保持其存活。
1.2.2主要试剂PCR所用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；DNA提取试剂盒（DNeasyBloodTissueKit）购自德国Qiagen公司；其他试剂均为分析纯。
1.3实验方法
1.3.1蜱种鉴定参照《中国经济昆虫志》［9］，用普通解剖显微镜将324只蜱进行形态学鉴定，初步分类后，从中选取50只用配备数码照相功能的解剖显微镜（LEICAM165C）拍摄图片，对蜱的盾板、假头、假头基、肛侧板、气门板、第一缘垛、孔区（雌蜱）等形态进行对比观察并测量［11］。1.3.2蜱的处理和DNA提取将蜱标本分别依次用浓度为70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37℃摇床中振荡冲洗1h，再用超纯水反复冲洗，干燥。最后置于消毒灭菌的1.5mlEP管中。按照DNA提取试剂盒使用说明书提取虫体基因组DNA，置-20℃保存备用。
1.3.3基因扩增用上游引物5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′，下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′扩增线粒体16SrRNA序列［12］；上游引物5′-CAAAAWCCTGGTAAAATTAAA-3′和下游引物5′-GCACTATCAAGCAACACGACT-3′扩增COⅠ序列［10］。25μlPCR反应体系：模板1.5μl（约50ng），上游和下游引物各0.75μl（75pmol），50mmol/LKCl，10mmol/LTris⁃HCl（pH8.3），1.5mmol/LMgCl2，1单位TaqDNA聚合酶。PCR反应循环参数为：①16SrRNA为94℃预变性5min，92℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共38个循环，72℃终延伸8min。②COⅠ为94℃预变性5min，92℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，共38个循环，72℃终延伸8min。扩增片段后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.3.4序列分析及系统进化树构建结合GenBank登录的图兰扇头蜱的16SrRNA和COⅠ参考序列，将本实验PCR扩增的6条16SrRNA及6条COⅠ序列测序结果与参考序列比对，运用Mega5.0软件的ClustalX程序分析，计算遗传距离并构建遗传进化树。
2结果
2.1蜱种鉴定所鉴定蜱共324只（168、156），虫体体型较小，雌虫体长3.2～5.5mm，雄虫体长2.9～3.6mm，呈褐色，背腹扁平似卵圆形，芝麻至米粒大，雌蜱饱血后可膨胀达蓖麻籽大。体分为假头和躯体两个主要部分（图1A）。假头基呈六角形，侧角明显，后缘微凹（图1B）。雄蜱盾板覆盖整个背部，雌蜱盾板覆盖背前部，前部较窄，后部圆钝，盾板遍布刻点，以细刻点居多，粗刻点少而零散（图1C）。眼卵圆，靠近盾板前部边缘。须肢粗短，中部最宽，前端稍窄。雄蜱气门板长卵形（图1D）。体端有缘垛，中垛大于边垛，常有尾突（图1E）。有肛沟，雄性肛侧板后缘内斜明显，内缘具角突，长约为宽的2.5～3.0倍，内缘中部稍凹，后缘向内显著倾斜，其后方凸角明显（图1F）。结合有关文献［9中国近代史读后感，13］认为伊宁县的蜱具有硬蜱科扇头蜱属图兰扇头蜱的特征。但由于吸血、饱血雌蜱及部分未成熟或形态变异的雄蜱，仅用传统形态学分类方法不能准确区分。因此，从324只中选出6只雌雄分别具有形态差异的蜱（4、2），根据采集地点分别将其命名为YN-1、YN-2、YN-3、YN-4、YN-5和YN-6。YN-1为当地典型雄性图兰扇头蜱；YN-2和YN-3为半饱血雌蜱，因其腹部吸血膨胀已无法观察缘垛，肛侧板和副肛侧板难以区分形态且边界不清；YN-4、YN-5和YN-6为部分形态特征改变雄蜱，YN4和YN5体端较宽似倒置三角形与典型的图兰扇头蜱卵圆形体端不同，且YN5气门板呈长逗点形与血红扇头蜱气门板相似；YN6肛侧板后缘圆钝，凸角不明显。因此对这6只蜱采用分子生物学方法进一步分析，对上述形态学鉴定结果进一步验证。
2.2分子生物学鉴定
2.2.1PCR扩增通过PCR扩增上述形态学差异较大的6只图兰扇头蜱线粒体DNA，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均获得特异性很好的PCR产物，与预期目的片段一致（16SrRNA约为460bp，COⅠ约为760bp）。
2.2.2图兰扇头蜱16SrRNA和COⅠ基因片段组成利用Mega5.0软件计算6只图兰扇头蜱的16SrRNA和COⅠ基因片段碱基组成。16SrRNA基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分别为36.68%、37.12%、10.7%和15.5%，碱基A＋T平均含量是73.78%。COⅠ基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分别为38.56%、31.78%、14.12%和15.54%，碱基A＋T平均含量是70.34%。
2.2.3图兰扇头蜱基因序列比对及系统进化树运用Mega5.0软件的ClustalX程序进行多重序列比对后，16SrRNA获得2种不同序列，并登录GenBank，登录号分别为KF547987和KF547989；COⅠ获得3种不同序列，登录号分别为KF68我的小天地作文200字8136、KF688137和KF688138。各结合GenBank登录的3种扇头蜱的参考序列构建系统进化树。6只图兰扇头蜱16SrRNA基因片段的遗传变异很小，共检测出2个单倍型，1个变异位点。其中YN-2、YN-3、YN-4和YN-5序列相同，为一种单倍型；YN-1、YN-6在216位点处为转换位点（T-C），为一种单倍型。基因序列比较结果显示同源性均在99.5%以上，遗传距离为0.3%～0.5%。而上述6只图兰扇头蜱的COⅠ基因片段序列变异较大，共检测出3个单倍型，4个变异位点。YN-1、YN-2和YN-6序列相同，为一种单倍型；YN-3和YN-5检测到3个变异位点，均为转换位点（A-G），无插入/缺失和颠换现象；YN-4在上述变异基础上，于574位点处发生转换（A-G）。基因序列比较结果显示同源性均在98.6%以上，遗传距离为0.3%～1.9%。
3讨论
调查结果表明新疆伊宁县绵羊体表普遍寄生了图兰扇头蜱，据以往报道图兰扇头蜱主要分布于新疆的巴楚、喀什、霍城、和田、哈密、呼图壁、库尔勒、轮台、阿瓦提、沙雅、于田等荒漠草原和荒漠地区［14］。而伊宁县地处亚欧大陆腹地，伊犁河谷中部，属中温带干旱型内陆山地气候，该地区气候温和，水源充沛，水草丰茂，以往并不适合图兰扇头蜱的生存繁殖，而此次在伊宁县发现图兰扇头蜱分布普遍，可能与新疆北疆近30年雨水过少、特殊的植被分布及气候改变有关。线粒体基因已成为群体遗传学和进化生物学研究中的重要分子标记。Murrell等［15］认为线粒体基因对于分子进化的研究具有很大价值，且更适于种内遗传差异的分析。目前蜱类研究中用的最多的线粒体基因为12SrRNA、16SrRNA、COⅠ和COⅡ等基因［10］。线粒体上的不同基因具有不同的解析功能，同一基因在不同的物种间也具有不同的解析能力。并且，在系统发育研究中多个数据比单个数据的效果要好，16SrRNA基因序列由于其保守性和存在的普遍性，被大量用于蜱六一儿童节作文300字类的物种鉴定和系统研究［12，16-17］。COⅠ基因是线粒体呼吸链末端的一个催化酶，比其他基因在生化功能的研究上更完备，普遍存在于真核生物和原核物细胞的线粒体中；此外，COⅠ基因是核基因组以外独立的线粒体环状DNA，所以能够用来比较其在生物进化上的相互关系［18］。吕继洲等［19］通过16SrRNA和COⅠ基因鉴定小亚璃眼蜱（H.anatolicum）、亚洲璃眼蜱（H.asiaticum）和残缘璃眼蜱（H.detritum）3种形态上极其相近的蜱种。一般来说，在变异程度上16SrRNA基因较COⅠ基因明显保守［20］，本实验研究结果也证实了这一观点。并且，通过对2个基因的研究发现，该地区图兰扇头蜱种内遗传差异显著，证实图兰扇头蜱具有生物多样性。由于蜱传播病原体一般与蜱种之间存在着一定的对应关系，亲缘关系越近的蜱种，其传播相同病原体的机会越大［21］。因此，不同蜱种的种内遗传差异与蜱传疾病的变化仍需进一步研究，为蜱媒病的预防控制提供依据。
作者：杜景云牟路萌张璘王丽娜王安东张科陈创夫王远志单位：新疆石河子大学医学院山东省济南市中心医院新疆石河子大学动物科技学院河南省平顶山学院新农村发展研究院
1实验教学应注重实际联系理论
生物化学实验既是实践教学的课堂，又是学生理解、掌握和运用知识的重要途径。利用生物化学实验课可以进一步拓展其与理论知识相联系的空间。然而在实验课上，我们发现部分学生只会按部就班地操作，只重视实验结果正确与否，采取应付了事的做法。因此，在实验开始时我们可以采用提问等方式帮助学生复习巩固相关的理论知识，引出实验目的，这样学生就会充分认识到理论知识对于指导实验操作的重要性;而另一方面，实验结束时总结分析，通过实验操作也加深了对理论知识的进一步理解。实验过程中，应激发学生动手实践的兴趣，增强其独立完成实验的信心，注意并引导其注重观察实验现象，遇到实验结果不一致的情况，我们应鼓励他们自己寻找原因，从而培养他们敏锐的观察力和锻炼他们分析、解决问题的能力。例如在“温度影响尿素酶活性因素”的实验中，应该是55度反应的试管中颜色最深，可部分学生做出的结果不尽相同，这就要引导他们思考分析在实验操作中是否注意“预温”、“按一定顺序滴加试剂”等细节。
2实验教学应注重培养基本实验技能
熟练扎实的实验技能是能否做好一个实验的先决条件，规范操作是保证实验结果准确可信的必要前提。因此在第一次做实验时就要给学生强调实验技能在实验过程中的重要性，以便学生自主加强基本技能和基本操作的训练，如试管、烧杯的刷洗，刻度吸管、加样枪的使用等。教师要认真示范，不仅要教会学生如何使用，而且要求学生熟练掌握使用方法，对可能的错误操作进行特别的提醒。实验中不断巡视督促，及时指正学生在操作过程中出现的错误。对首次使用的仪器简要介绍其原理，严格按仪器的操作规程进行示范，让学生养成认真严谨、规范操作的实验习惯，从而提高实验课的质量。
3实验教学应积极探索新的教学模式
传统的实验教学主要是以验证性、基础性实验为主;且实验教材内容稍显陈旧，技术手段滞后，不能反映当今科学的前沿。同时由于实验预期结果较明确，容易造成学生兴趣不高、消极怠工，编造数据或是抄袭报告的现象时有发生［2］。近年来，生命科学尤其是分子生物学的发展迅速极快，应尽可能地让学生接触和了解更多的新技术、新知识。同时为了顺应医学发展的需要，培养基本功扎实、动手能力强的高素质医学人才，我们改变原有教学理念，积极探索新的实验教学模式，将实验内容分成2个实验模块，即生物化学实验和分子生物学实验，涵盖了生物化学与分子生物学的基本实验技术，锻炼了学生的动手与思考能力，体现了设计性和综合性，也促进了师资队伍学术水平和教学水平的提高。
例如我们将“影响酶活性因素”调整为设计性实验，通过设立相关的问题和讨论点，指导学生查阅文献资料、合理制定方案、自行开展实验，引导学生思考、讨论、分析和评价问题。这种提问式、引导式的实验教学新模式始终让学生处于主体地位，能激发学生的学习热情，活跃课堂气氛，有助于学生科研素养的养成和创新综合能力的培养。同时也进一步增强了教学老师的综合素质，提高了教学的品质，从而达到实践教学与理论教学互融互动的良好效果［3］。而通过综合性大实验的开设，有助于学生对于各章节理论知识的掌握和融会贯通。例如我们开设了“基因组DNA的提取、检测及PCR扩增”、“质粒DNA抽提、酶切、连接”、“感受态细胞的制备及重组质粒的转化鉴定”三个分子生物学综合性实验，构成了一个完整的基因工程的实验流程，使学生对重组DNA技术的基本原理和操作步骤有了直观的认识，并掌握了离心、电泳、分光光度技术等生化重要技术。每一个实验之间环环相扣，相辅相成，前一个实验的成功与否直接会影响接下来的实验结果。因此如果想完整地做好一个综合性大实验，学生的注意力会更加集中，而且在实验的过程中无论从理论知识方面，还是实验技能的操作方面都会得到很大程度的提高。
另外由于某些实验如电泳、摇菌时，等待实验结果的时间较长，为了充分利用这些空余时间，我们将多媒体引入实验教学中，播放某些受限不能开设的实验的相关视频，从而让学生了解生化方面的前沿进展与新兴技术，这样既增加了课堂的生动性，也提高了实验效率和教学质量。作为一名合格的生物化学与分子生物学实验教师，需要不断探索和改进实验教学的方法，要注重理论和实验的结合。只有教与学实现了良好互动的实验课，才能既加强学生基本操作和技能训练，又巩固其对理论知识的掌握，锻炼学生将所学知识运用于实践中。
作者：许志臻陈敏陈岺曦赵力连继勤何凤田单位：第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室
